DETERMINACIÓN DEL VALOR HEMATOCRITO MEDIANTE EL MICROMÉTODO

Fecha: 21 de noviembre,2014.

Fundamento: Aprender a determinar el valor del hermatocrito de una muestra.

Material: tubos capilares, plastilina, gasas (o algodón), centrífua de microhematocrito, regla milimetrada o un lector de microhematocrito.

Muestra: sangre capilar o sangre venosa (con EDTA).

Desarrollo:

-Llenamos dos capilares con la sangre, 3/4 partes de su longitud.

-Limpiamos el exterior de cada capilar con una gasa.

-Sellamos el extremo de cada capilar con plastilina. Para ello introducimos el capilar por la plastilina, lo haremos unas 3 veces más o menos.

-Colocamos los capilares enfrentados en la centrífuga de microhematocrito.

-Centrifugamos los capilares a unas 12.000g durante 5 minutos.

-Una vez pasado ese tiempo hacemos los cálculos pertinentes que pueden ser de dos maneras:

• Medimos las columnas formados en el interior de cada tubo con una simple regla milimetrada y calculando, seguidamente, el porcentaje que le corresponde a la columna de eritrocitos, mediante una sencilla regla de tres.
• Mediante un lector de microhematocrito.

·         

Observaciones: Los resultados no serán exactos ya que la muestra de sangre utilizada lleva mucho tiempo en la nevera.

Resultados y cálculos:

Interpretación de los resultados: El valor normal del HCT está comprendido entre el 42 y el 47% en las mujeres, y entre el 45 y 52% en los varones. Un valor bajo del HCT suele ser signo del padecimiento de una anemia, aunque puede haber falsos descensos. Un  valor alto de HCT suele ser signo de una poliglobulina. En nuestro caso el HCT está un nivel bajo eso se debe al tiempo en la nevera de la muestra sanguínea.

Hoja de trabajo:

1.¿Qué significa la franja roja que tienen algunos capilares de microhematocrito? La franja roja significa que esos capilares están heparinizados.

2.¿A qué fuerza relativa de centrifugación (g) se centrifuga la sangre? La sangre se centrifuga entre 2.000 g y 5.000 g, con el macrométodo, y entre 12.000g y 15.000g, con el micrométodo.

3.Si la medida de la columna de eritrocitos es de 20mm y la de la  columna total es de 50mm, ¿cuál es el valor del hematocrito? El valor es de un 40%

4.Si con un capilar se obtiene un HCT de 45 y con el otro uno de 43, ¿cómo debe ser la forma de actuar ante estos resultados? Al no superar el 2% del más alto de ellos se calcula la media de los valores obtenidos.

RECUENTO DE HEMATÍES

Fecha: 21 de noviembre,2014

Fundamento: Realizar un RBC de una muestra de sangre, con la cámara de recuento.

Material: Pipeta de Thoma, tubo de goma con boquilla, prepipeta, cámara de recuento Neubauer, cubreobjetos y microscopio.

Reactivos: Líquido de Hayem.

Muestra: sangre capilar o sangre venosa anticoagulada con EDTA.

Desarrollo:

-Humedecemos las bandas laterales del retículo de la cámara con agua destilada (para adherir bien el cubreobjetos) y colocamos el cubreobjetos sobre el retículo de la cámara.

-Colocamos el tubo de goma en la pipeta de Thoma y en la prepipeta.

-Aspiramos la sangre hasta la señal de 1 y limpiamos cuidadosamente el exterior de la pipeta sin bajar el nivel de sangre.

-Sin soltar la sangre de la pipeta Thoma, aspiramos líquido de Hayem hasta la señal de 101.

-Colocamos el dedo pulgar en la punta de la pipeta, desganchamos la goma de la pipeta y colocamos el dedo índice.

-Sujetando la pipeta con los dos dedos, agitamos suavemente la pipeta Thoma durante 2 ó 3 minutos.

-Apartamos el dedo pulgar y desechamos las 3 primeras gotas de la pipeta.

-La siguiente gota la depositamos entre la cámara y el cubreobjetos. (hay que evitar que se formen burbujas y que rebose).

-Dejamos reposar la sangre diluida de la cámara para que las células puedan sedimentarse.

-Colocamos la cámara en el microscopio, enfocamos con el objetivo de 40x y verificamos que la distribución de los hematíes es homogénea.

-Contamos los hematíes encontrados en los 4 cuadrados medianos de la esquina y el cuadrado mediano del centro.

Observaciones: El resultado no sale correcto ya que la sangre utilizada lleva mucho tiempo en la nevera y eso deteriora la cantidad de hematíes.

Resultados:

Hay que calcular el RBC con la siguiente fórmula:   RBC=Hx5x10xD

RBC=recuento de hematíes

H= hematíes contados en 5 cuadrados medianos

D= factor de dilución

RBC= (117+103+81+110+70)x5x10x100; RBC=481x5x10x100; RBC=2405000; RBC=2’405 millones/mm3

Interpretación de los resultados: Si se disminuye el RBC tenemos un caso de anemia, en cambio si el RBC tenemos un caso de policitemia. Los valores normales son entre 4 y 5 millones/mm3 en el caso de las mujeres, y entre los 4’54 y 6 millones/mm3 en el caso de los varones. En nuestro caso sale muy por debajo de lo normal lo que puede ser por tener anemia o porque la sangre lleva mucho tiempo en la nevera.

Hoja de trabajo:

1.¿Qué se debe hacer si el líquido de Hayem contiene precipitados? Hay que filtrarlo

2.¿Cuál es el volumen de sangre diluida que hay sobre cada uno de los cuadrados pequeños donde se han contado los hemtaíes? En cada uno hay 0’05mm3

3.¿Cuál es el volumen de sangre diluida que hay sobre cada uno de los cuadrados medianos donde se han contado los hematíes?

4.¿Cuál es el volumen de sangre diluida que hay sobre el cuadrado central?

5.Si la pipeta Thoma se enrasa con sangre hasta la señal de 1, ¿cuál es la dilución posteriormente obtenida?

6.¿Si la sangre se diluye a 1/200 y se cuentan 450 hematíes en 5 cuadrados medianos, ¿cuál es el RBC obtenido? RBC=450x5x10x200; RBC=4500000; RBC=4’5 millones/mm3

VISUALIZACIÓN DE UNA CÁMARA DE RECUENTO

Fecha: 20 de noviembre,2014.

Fundamento: Aprender a visualizar una cámara de recuento con el microscopio.

Material: microscopio, cámara Neubauer.

Desarrollo:

-Observamos con el microscopio (con todos los objetivos) el retículo de la cámara de recuento.

-Enfocamos con el objetivo de 10x, uno de los cuadrados grandes situado en las cuatro esquinas del retículo.

-Contamos el número de cuadrados medianos contenidos en ese cuadro grande periférico.

-Enfocamos, con el objetivo de 10x, el cuadrado grande central.

-Contamos el número de cuadrados medianos contenidos en ese cuadro.

-Contamos el número de cuadrados pequeños englobados en uno de esos cuadrados medianos.

Ejercicios:

(Paso 2 y 3 del desarrollo)

Teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3 mm, calcular:

·         La longitud de los lados de cada cuadrado grande periférico: 1mm

·         La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos englobados en un cuadrado grande periférico: 0’25 mm

Teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0’1mm, calcular el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada, a nivel de:

·         El retículo entero: 0’9mm3 (0’1*3*3)

·         Un cuadrado grande periférico: 0’1mm3

·         Un cuadrado mediano incluido en un cuadrado grande periférico: 0’025mm3

(Paso 4 y 5 del desarrollo)

Contar el número de cuadrados mediaos contenidos en ese cuadrado grande:

Contar el número de cuadrados pequeños englobados en uno de esos cuadrados medianos: 16 cuadrados

Teniendo en cuenta que la longitud de cada uno de los lados del retículo es de 3mm, calcular:

·         La longitud de los lados del cuadrado grande central: 1mm

·         La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados medianos incluidos en el cuadrado grande central: 0’2mm (2:5)

·        La longitud de los lados de cada uno de los cuadrados pequeños contenidos en uno de esos cuadrados medianos: 0’05mm

Teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0’1mm, calcular el volumen de sangre diluida que hay en la cámara de recuento montada, a nivel de:

·         El cuadro grande central: 0’1mm3

·         Un cuadro  mediano englobado en el cuadrado grande central: 0’05mm3

·         Un cuadrado pequeño incluido en uno de esos cuadros medianos: 0'05mm3

TINCIÓN PANÓPTICO RÁPIDO

Fecha: 13 de noviembre, 2014.

Fundamento: Realizar una tinción de panóptico rápido  para la visualización de las diferentes estructuras celulares.

Material: 3 duquesitas, portaobjetos, frasco lavador.

Sustancias y reactivos: Solución nº1: solución alcohólica de triarilmetano, solución nº2: solución tamponada de xanteno, solución nº3: solución tamponada de tiazina, agua destilada, aceite de inmersión.

Muestra:Sangre capilar o sangre venosa anticoagulada.

Desarrollo:

-Realizamos una extensión sanguínea (véase Práctica VII) y la dejamos secar.

-Se colocan las tres soluciones en las duquesitas (una en cada una) y anotamos los números en las tapas de cada solución.

-Cogemos la extensión sanguínea y la sumergimos, en la primera solución, durante 1 segundo y repetimos este procedimiento 4 veces más (en total 5 segundos en la primera solución).

-Sumergimos a continuación otras cinco veces (cada una de un segundo de duración) en la duquesita de la solución 2.

-Sumergimos otras cinco veces, cada una de un segundo, en la duquesita de la solución 3.

-Lavamos la extensión con agua destilada y la dejamos secar.

-Una vez seca la extensión le añadimos una gota de aceite de inmersión para observarla con el objetivo 100x en el microscopio.

Observaciones: Al limpiarla con agua destilada una parte de la extensión se ha ido. Este método de tinción tiene la misma calidad que los métodos clásicos (Giemsa y Wright) y además su ejecución es más rápida.

Resultados:

Interpretación de los resultados: Las coloraciones obtenidas en las células obtenidas son similares a las de la tinción de Wright y Giemsa (Práctica X, Práctica IX). Los eritrocitos están coloreados de un color salmón oscuro,  las plaquetas de color violeta y además se han podido ver Neutrófilos (el núcleo de color azul tirando a violeta y el citoplasma rosa) y monocitos (núcleo color violeta y citoplasma azul).

Hoja de trabajo:

1.¿En qué se diferencia este método de las otras tinciones clásicas? Este método tiene una ejecución más rápida que la clásica (15 segundos) y la extensión se sumerge en las soluciones  (en los otros métodos se extienden sobre la extensión).

2.¿Cuántos segundos debe sumergirse el frotis en cada una de las soluciones? Se debe sumergir la extensión 5 segundos en cada solución (5 inmersiones de 1 segundo).

3.¿Cuál cree que es la solución fijadora? La primera ya que contiene metanol.

TINCIÓN DE WRIGHT

Fecha: 13 de noviembre, 2014.

Fundamento: Realizar una tinción de Wright para la visualización de las diferentes estructuras celulares.

Material: microscopio, cristalizador, puentes de tinción, pipetas Pasteur, tubos de ensayo, gradilla, portaobjetos.

Reactivos y sustancias: solución de Wright, solución tampón pH 7’2, aceite de inmersión.

Muestra: Sangre capilar o sangre venosa anticoagulada.

Desarrollo:

-Realizamos una extensión sanguínea muy fina (véase Práctica VII).

-Sobre el cristalizador colocamos el puente de tinción y sobre este la extensión.

-Sobre la extensión, le añadimos 1 ml de Wright y lo dejamos actuar durante 1 minuto.

-Pasado el minuto, lavamos la extensión con solución tampón pH 7’2 y la dejamos escurrir en posición vertical.

-En un tubo de ensayo, diluimos 0’5 ml de Wright con 0’5 ml de solución tampón pH 7’2 y lo mezclamos bien.

-Cubrimos la extensión, con una pipeta pasteur, con la disolución y la dejamos actuar entre 3 y 5 minutos.

-Pasado este tiempo, lavamos la extensión con agua del grifo y después la lavamos con solución tampón pH 7’2, y la dejamos secar en posición vertical.

-Una vez seca la extensión,  le añadimos una gota de aceite de inmersión para observar con el objetivo de 100x en el microscopio.

Observaciones: Igual que en la tinción de Giemsa, no se pueden observar glóbulos blancos ya que la sangre utilizada lleva bastante tiempo en el frigorífico.

Resultados:

Interpretación de los resultados: Se puede observar prácticamente igual que en la tinción de Giemsa (Práctica IX), los eritrocitos se tiñen de color rosado oscuro y las plaquetas de color violeta.

Hoja de trabajo:

1.¿Qué tipo de colorante utilizamos en esta tinción? Utilizamos colorante Wright

2.¿Qué sustancia empleamos como fijador? Como el colorante contiene metanol no es necesario un paso previo de fijación.

3.¿Cuánto tiempo debe estar en contacto el frotis con el colorante diluido? Debe estar entre 3 y 5 minutos.

TINCIÓN DE GIEMSA

Fecha: 11 de noviembre, 2014.

Fundamento: Realizar una tinción de Giemsa, para la visualización de las diferentes estructuras celulares.

Material: Microscopio, 2 portaobjetos, cristalizador, puente de tinción, pipetas Pasteur y tubos de ensayo.

Reactivos y sustancias: Colorante Giemsa, solución tampón pH 7’2, metanol, aceite de inmersión.

Muestra: sangre capilar o sangre venosa anticoagulada (heparina o EDTA).

Desarrollo:

-Preparamos una extensión sanguínea (véase Práctica VII).

-Colocamos el puente de tinción sobre el cristalizador, y sobre el puente colocamos la extensión.

-Cubrimos la extensión con metanol durante 3 minutos. Lo escurrimos y lo dejamos secar.

-Diluimos, en un tubo de ensayo, 0,2 ml de Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7’2 y lo homogenizamos.

-Con la ayuda de una pipeta Pasteur, cubrimos toda la extensión con la dilución de Giemsa y lo dejamos actuar durante 25 minutos.

-Transcurrido ese tiempo, escurrimos y lavamos la extensión con agua del grifo y después lo lavamos con solución tampón pH 7’2 hasta eliminar los restos del colorante y lo dejamos secar en posición vertical.

-Una vez seca la extensión colocamos una gota de inmersión para visualizarla con el objetivo de 100x en el microscopio.

Observaciones: Al observar la extensión por el microscopio no se pueden observar glóbulos blancos ya que es de la sangre guardada en el laboratorio y lleva mucho tiempo, por lo tanto los neutrófilos han desaparecido ya.

Resultados:

Interpretación de los resultados: En la extensión se pueden observar los eritrocitos oscuros y las plaquetas de color violeta.

Hoja de trabajo:

1.¿Cuáles son los anticoagulantes más adecuados para esta técnica? Heparina o EDTA

2.¿Con qué reactivo fijamos el frotis? Lo fijamos con metanol

3.¿Cuánto tiempo debe actuar el colorante en el frotis? El colorante debe actuar durante 25 minutos.

PREPARACIÓN DE GOTA GRUESA

Fecha: 10 de noviembre,2014

Fundamento: Realizar una preparación de gota gruesa para observar si hay parásitos palúdicos.

Material: capilar, pipeta Pasteur, 2 portaobjetos, cristalizador, puente de tinción, microscopio.

Reactivos y sustancias: Metanol, agua destilada, solución colorante Giemsa (3%) con agua destilada.

Muestra: sangre capilar o venosa anticoagulada con heparina o EDTA.

Desarrollo:

-Sujetamos, sólo por los bordes, un portaobjetos limpio.

-Colocamos una pequeña gota de sangre en el centro del portaobjetos y realizamos una extensión en capa fina.

-A la derecha de donde hemos puesto la pequeña gota, añadimos tres gotas más grandes y formando como un triángulo y las unimos (con movimientos rápidos y circulares con el otro portaobjetos) hasta extenderlas formando una capa gruesa y uniforme.

-Dejamos que se seque la preparación y fijamos la extensión fina. Después la dejamos secar durante 24 horas.

-Colocamos un puente de tinción encima de un cristalizador, y colocamos la preparación encima del puente.

-Con la ayuda de una pipeta Pasteur, añadimos el colorante (Giemsa 3%) a la preparación y dejamos actuar durante 30-45 minutos.

-Una vez transcurrido ese tiempo, limpiamos con agua destilada el exceso de coloración y la dejamos secar en posición vertical.

-Lo observamos en el microscopio.

Observaciones: La preparación de gota gruesa se hacen para observar si existe la enfermedad de paludismo. Hay cuatro especies de parásitos palúdicos: plasmodium vivax, plasmodium ovale, plasmoduim malarie y plasmoduim falciparum. En la preparación de la gota gruesa, los hematíes están lisados, por lo que el diagnóstico de paludismo se basa en el aspecto de los parásitos que puedan encontrarse.

Resultados e intepretación de resultados:

Al observar la preparación en el microscopio se puede observar que no hay parásitos palúdicos, por lo tanto el individuo del que procede la muestra de sangre no está infestado por plasmodium.

Hoja de trabajo:

1.¿Qué se utiliza para teñir la preparación de gota gruesa? Una preparación de colorante Giemsa al 3% con agua destilada.

2.¿Cómo están los hematíes en la preparación de gota gruesa? Los hematíes están lisados.

3.¿Con qué sustancias se fija la preparación de gota gruesa? La preparación es fijada con metanol. 

REALIZACIÓN DE UNA EXTENSIÓN SANGUÍNEA

Fecha: 10 de noviembre, 2014

Fundamento: Realizar correctamente una extensión sanguínea

Material: Tubo de ensayo, gradilla, capilar, 2 portaobjetos, rotulador de vidrio.

Muestra: sangre capilar anticoagulada o sangre venosa adecuadamente anticoagulada.

Desarrollo:

-Situamos un portaobjetos apoyado en la mesa y lo sujetamos con los dedos índice y pulgar de una mano.

-Llenamos un capilar con sangre, y depositamos una pequeña gota de ésta en el portaobjetos que estamos sujetando en el extremo opuesto del que agarramos.

-Colocamos un extremo del portaobjetos extensor, un poco por delante de la gota que hemos echado y formando un ángulo de 45º con el otro porta.

-Desplazamos lentamente el portaobjetos extensor hacia atrás, hasta que alcancemos la gota de sangre y esperamos a que la gota se expanda por el extremo del portaobjetos extensor.

-Deslizamos el portaobjetos extensor hacia delante, con un movimiento firme y uniforme, a una velocidad media.

-Secamos rápidamente la extensión, agitándola al aire, para que no se distorsionen las células.

-Escribimos el nombre de la persona.

Observaciones: no todas las extensiones salen correctamente, ya que podemos cometer fallos en la forma de hacerla o que los portaobjetos no estén de forma adecuada (sucios o rallados). Los defectos más comunes son:

-Extensión corta y gruesa o extensión larga y muy fina, suelen suceder cuando la gota de sangre echada es inadecuada y/o un fallo de ángulo y velocidad en hacer la extensión.

-Extensión con estrías transversales o estrías longitudinales, se debe por una falta de uniformidad en el deslizamiento.

-Extensión con zonas sin sangre, se debe por suciedad del portaobjetos

-Extensión con extremo final muy desflecado, sucede cuando el borde del portaobjetos extensor es muy irregular

Resultados:

Interpretación de los resultados: Las extensiones no son válidas ya que los portaobjetos estaban sucios (y por mucho que se lavaran seguían sucios  -.-“) y salían zonas sin sangre.

Hoja de trabajo:

1.¿Con qué sustancia se anticoagula la sangre venosa cuando se pretende hacer una extensión? Se anticoagula con EDTA

2.¿Cuánto tiempo puede pasar, como máximo, desde la extracción de la sangre hasta la realización del frotis? Pueden pasar como máximo 3 horas.

3.¿Qué ángulo debe formar el porta extensor con el porta soporte? Debe formar un ángulo de 45º aproximadamente.

TINCIÓN SUPRAVITAL CON AZUL DE METILENO

Fecha: 7 de noviembre, 2014

Fundamento: Observar, con el microscopio, una tinción supravital de sangre, utilizando como colorante el azul de metileno.

Materiales: 

-Para el colorante: matraz aforado, embudo, varilla agitadora, vidrio de reloj, báscula, vaso de precipitado, espátula, pipeta pasteur, parafilm.

-Para la muestra: microscopio, portaobjetos y cubreobjetos, tubos de hemólisis, gradilla, pipeta pasteur, parafilm, lanceta, gasas.

Reactivos y sustancias: azul de metileno, oxalato potásico, agua destilada, alcohol.

Muestra: sangre capilar fresca.

Desarrollo:

-Preparamos el colorante de la siguiente manera:

• ·         Con un vidrio de reloj pesamos 0’5g de azul de metileno y 1’6g de oxalato potásico. Lo añadimos a un vaso de precipitado y le echamos agua destilada.
• ·         Una vez disuelto, con la ayuda de un embudo y la varilla, lo añadimos en un matraz aforado (de 100ml).
• ·         Vamos añadiendo agua hasta enrasar el matraz. Tapamos con un parafilm y homogenizamos.

-Con una pipeta pasteur, añadimos dos gotas del colorante hecho en un tubo de hemólisis. Después  con la ayuda de una lanceta (desinfectando primero el dedo con alcohol y desechando la primera gota de sangre), añadimos dos gotas de sangre en el mismo tubo de hemólisis.

-Tapamos el tubo con parafilm y dejamos la mezcla en reposo durante 10 minutos.

-Después de ese tiempo, cogemos una o dos gotas de la mezcla (con una pipeta pasteur) y la colocamos en un portaobjetos. Cubrimos la mezcla con un cubreobjetos.

-Colocamos la preparación en la platina del microscopio y la observamos con el objetivo de 40x.

Observaciones: Las tinciones de tejido o células vivas pueden ser: tinciones vitales (introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo) o tinciones supravitales (emplean el colorante sobre células o tejidos vivos aislados del organismo. En este caso es una tinción supravital.

Los colorantes vitales más utilizados son: el rojo neutro, el verde Jano y el azul de metileno. En este caso utilizaremos el azul de metileno que tiñe núcleos y algunas estructuras celulares.

Resultado:

Interpretación de los resultados: Se pueden apreciar los núcleos celulares teñidos de azul, mientras los glóbulos rojos se ven, más o menos, como en la práctica de la sangre en fresco ya que no tienen  núcleo.

Hoja de trabajo:
1.¿En qué se diferencian una tinción vital de una supravital? En las tinciones vitales se introducen en el organismo vivo mientras que las supravitales emplea el colorante sobre células o tejidos vivos aislados del organismo
2.¿Cuáles son los colorantes vitales más utilizados? El rojo neutro, el verde Jano y el azul de metileno.
3.¿Cuáles son las ventajas de la tinción supravital?
4.¿Cuáles son los inconvenientes? La observación debe ser rápida ya que las células no permanecen vivas mucho tiempo.