PRUEBA CRUZADA MAYOR

Fecha:  22 de mayo, 2015

Fundamento:  Enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, para detectar las posibles reacciones antígeno-anticuerpo ante la sangre del donante y del receptor.

Material:  tubos de hemólisis, centrífuga, baño de agua, pipetas pasteur, gradilla

Reactivos: suero fisiológico, albúmina bovina al 30%, suero de Coombs 
Muestra:  Suero del receptor (de menos de 24 horas y conservado a 4ºC) y hematíes del donante (lavados préviamente y en una suspesión al 5%).
Desarrollo:
-En un tubo de hemólisis, depositamos una gota de la suspensión de hematíes y dos gotas del suero del receptor.
-Homogenizamos y dejamos reposar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.
-Centrifugamos a 3.500 rpm durante 1 minuto y observamos el resultado.
-Añadimos al tubo 3 gotas de albúmina, mezclamos bien e incubamos a 37ºC durante 30 minutos.
-Centrifugamos a 3.500 rpm durante 1 minutos y observamos el resultado.
-Lavamos los hematíes tres veces y retiramos bien todo el sobrenadante en el último lavado.
-Añadimos al tubo una gota de suero de Coombs y mezclamos bien
-Centrifugamos a 1.000 rpm durante 2 minutos y se observa los resultados.
Observaciones: En caso de que en cualquiera de las fases haya aglutinación o si se observa hemólisis, las sangres son incompatibles. 
Resultados:

Interpretación de los resultados: Existe  una ausencia de aglutinación, por lo tanto las sangres son compatibles y se puede  realizar la transfusión.
Hoja de trabajo
1.¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor? Se enfrenta el suero del receptor con los hematíes del donante.

2.¿Cuándo se debe realizar la prueba cruzada menor? Solo cuando se transfunde una gran cantidad de plasma.

3. ¿Porqué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoideo? Para detectar todos los anticuerpos presentes.

4. ¿Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina de Coombs? Pone de manifiesto los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.

DETERMINACIÓN RÁPIDA DE HEMOGLOBINA

Fecha:  22 de mayo, 2015

Fundamento:  Determinar la concentración de hemoglobina, justo antes de una donación, para observar si esta dentro de los valores permitidos.

Material:  vasos de precipitado, lanceta, gasas, embudo, matraz aforado, vidrio de reloj, espátula, varilla agitadora, probeta, micropipeta
Reactivos: sulfato de cobre, agua destilada, alcohol 
Muestra:  sangre capilar
Desarrollo: 
-Primeramente, preparamos la solución de sulfato de cobre de la siguiente manera:

• Mezclamos 17 g de sulfato de cobre en 100 ml de agua destilada (en el matraz aforado), esa será nuestra solución madre.
• A esa mezcla le añadimos 0'74 ml más de agua destilada.
• En una probeta, mezclamos 51 ml de la solución madre con 49 ml de agua destilada.

-En un vaso de precipitados, añadimos solución de sulfato de cobre.
-Con una lanceta, nos pinchamos en dedo y depositamos la gota en el vaso de precipitados con la solución de sulfato de cobre.
-Esperamos y observamos si la gota precipita
Observaciones: Si la gota problema cae libremente a través de la solución de sulfato de cobre, tiene una densidad mayor que 1'052 g/cm3 por lo que esa persona podrá ser donante. En el caso contrario la persona tendrá una densidad menor y por lo tanto no podrá ser donante.
Resultados:

Interpretación de los resultados: Las gotas de sangre han caído libremente por la solución de sulfato de cobre, por lo tanto la persona de la sangre problema puede ser donante.
Hoja de trabajo
1.¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación? El valor mínimo en mujeres es de 12'5 g/dl

2.¿Con qué otra solución comparamos la densidad de sangre? La comparamos con una solución de sulfato de cobre.

DETERMINACIÓN DE UN Du

Fecha:  20 de mayo, 2015

Fundamento:  Realizar la prueba de Coombs indirecta, para observar en la sangre problema si existe un antígeno D débil (Du)

Material:  tubos de centrífuga, centrífuga, pipetas pasteur, gradilla, baño de agua, reloj

Reactivos: Suero Anti-D, suero de Coombs, suero fisiológico
Muestra: Hematíes de la sangre problema en suspensión al 5%
Desarrollo: 
-En un tubo, añadimos una gota de suero anti-D y una gota de la suspensión de hematíes al 5% y lo mezclamos suavemente
-Incubamos el tubo a 37ºC durante 30-45 minutos.
-Después de incubar realizamos lavado de los hematíes, de la siguiente manera:

• En el tubo añadimos suero fisiologico (unos 4 ml) y añadimos en otro agua destilada para compensar.
• Centrifugamos el tubo a 2.000 rpm durante 4 minutos
• Después de centrifugar, retiramos el sobrenadante
• Repetimos el proceso dos veces mas
• Decantamos por completo el sobrenadante final

-Añadimos sobre el sedimento hemático una gota de suero de Coombs y mezclamos suavemente.
-Centrifugamos el tubo a 1.000 rpm durante 1 minuto
-Observamos si existe aglutinación
Observaciones: Para evitar falsos positivos (si existe aglutinación) debido a una sensibilización de los hematíes in vivo, debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes del problema. Este nos servirá como control negativo.
Resultados: 

Interpretación de los resultados:  Si aglutina el resultado es positivo, por lo tanto la sangre problema contiene el antígeno Du. En caso de no salir aglutinación el Rh será negativo. En nuestro caso los hematíes no han aglutinado, por lo tanto nuestra sangre problema es Rh negativo.
Hoja de trabajo
1.¿Qué contiene el suero de Coombs? El suero de Coombs contiene anticuerpos antiglobulina humana

2.¿Qué se detecta con la prueba directa? Detectamos anticuerpos incompletos que han sensibilizado los hematíes in vivo

3.¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta? Detectamos anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes

4.¿Qué buscamos en la sangre del paciente? Buscamos si puede tener un antígeno D débil

5.¿Qué ocurre si el control es positivo? Ha habido una sensibilización prévia de los hematíes in vivo, por lo que los resultados no son válidos.

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh

Fecha:  7 de mayo,2015

Fundamento:  Determinar el fenotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema con los sueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-e y anti-c, y con el fenotipo buscar el genotipo más probable

Material:  Tubos de centrífuga, centrífuga, rotulador de vidrio, pipetas pasteur, gradilla, visualizador luminoso

Reactivos:  Sueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-c,anti-e y suero salino
Muestra:  Suspensión de hematíes al 5% (véase práctica LX, en desarrollo)
Desarrollo:  
-Rotulamos cinco tubos de centrífuga, cada uno con la letra D, C, E, c y e.
-Añadimos una gota de suspensión de hematíes a cada tubo y una gota del suero correspondiente.
-Centrifugamos todos los tubos a 1.000 rpm durante 1 minuto
-Observamos si existe aglutinación o no con e visualizador luminoso
Observaciones: Para observar si existe aglutinación o no, golpeamos suavemente con los dedos en el fondo del tubo par despegar el botón hemático, si existe algutinación se observará grumos de color rojo.

Resultados: 

Interpretación de los resultados:  
En fenotipo obtenido es el siguiente: 

El/ los posible/s genotipo/s se puede/n obtener mediante esta tabla:

Por lo tanto, los posibles genotipos de la sangre problema son: dCe/dcE o dCE/dce

Hoja de trabajo
1.¿Qué antisueros se utilizan en esta técnica? Los antisueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-c y anti-e 

2.¿Por qué no existe suero anti-d? Porque no existe el antígeno d ni el anticuerpo anti-d

3.¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos? Expresan el fenotipo de la sangre analizada

4.Si la sangre es Rh+, ¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh? Exactamente no se podría ya que no se puede saber  si es Rh + heterozigotico o homozigotico

5.Si los resultados obtenidos son: D-, C-, E+, c+ y e-; ¿Cuál es el genotipo posible de esta sangre? El genotipo será dcE/dcE.

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO

Fecha: 5 de mayo, 2015

Fundamento: Determinar el grupo Rh de la muestra enfrentándolo al suero anti-D

Material: Tubos de centrífuga, pipetas pasteur, centrífuga, rotulador de vidrio, gradilla, vasos de precipitado,visualizador luminoso

Reactivos:  Suero anti-D, albúmina al 30% y suero fisiológico
Muestra:  Sangre venosa anticoagulada
Desarrollo:  
-Debemos obtener una suspensión de hematíes al 5% de la sangre problema de la siguiente manera:

• Añadimos 0'5 ml de la sangre problema en un tubo de centrífuga y lo rellenamos con suero fisiológico.
• Lo metemos en la centrífuga, y centrifugamos a 2.000rpm durante 4 minutos.
• Extraemos el sobrenadante y repetimos la operación dos veces más.
• Después de los tres lavados, añadiremos 250 microlitros de hematíes lavados en un tubo con 475 ml de suero salino y homogenizamos.

-Rotulamos dos tubos limpios con las letras D y A 
-En el tubo D añadimos una gota de suero anti-D y en el tubo A una gota de albúmina bovina al 30%
-A cada tubo le añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5% y agitamos suavemente para mezclar el contenido de los tubos.
-Centrifugamos los tubos a 1.000 rpm durante un 1 minuto.
-Después de la centrifugación observamos si ha habido aglutinación en el visualizador luminoso.
Observaciones:  El tubo con albúmina es un control negativo, por lo que si resulta una aglutinación el resultado de la prueba no es válido. Para ver si hay aglutinación o no se debe golpear suavemente el fondo de los tubos para despegar el botón hemático, si se resuspende es negativo y di se forman grumos de color rojo es positivo.

Resultados: 

Interpretación de los resultados:  Como se observa en la imagen, los dos tubos se han resuspendido por lo tanto el Rh de la muestra es negativo.
Hoja de trabajo
1.¿Por qué utilizamos el control de albúmina? Porque el control de albúmina es negativo y así evitamos los falsos positivos

2.¿Qué ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D? El Rh de la sangre problema es negativo

3.¿Qué debemos detectar mediante un Coombs indirecto? Debemos comprobar que el paciente no posee un Du

4.¿Cómo se prepara la muestra problema? Lavando los hematíes de la muestra problema y haciendo una suspensión de hematíes al 5%

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN PORTA

Fecha: 5 de mayo, 2015

Fundamento: Determinar el grupo Rh, enfrentando la sangre problema al suero anti-D

Material:  Portaobjetos, palillos agitadores, lancetas, gasas, visualizador luminoso, rotulador de vidrio

Reactivos:alcohol, suero anti-D y albúmina bovina al 30%
Muestra: Sangre capilar
Desarrollo:  
-Dividimos el portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio y marcar una con la letra S (de suero) y otro con la letra A (de albúmina).
-Con la lanceta nos pinchamos un dedo, y en cada sección añadimos una gota de sangre.
-Añadimos una gota de suero anti-D en la sección S y una gota de albúmina, en la sección A.
-Con los palillos mezclamos la sangre con el suero y la albúmina.
-Colocamos el porta en un visualizador luminoso y lo agitamos un poco para observarlo.
-Anotamos los resultados de la clase y realizamos una gráfica
Observaciones: La aglutinación se favorece con el calor, por lo que es imprescindible colocarlo en el visualizador luminoso para observar si hay aglutinación (aparición de grumos rojos sobre un fondo claro).

Resultados: 

Los resultados de toda la clase son:

Y la gráfica sería así: Gráfica grupo Rh

Interpretación de los resultados: En la sección S, se puede observar que existe aglutinación, por lo tanto el grupo Rh es positivo.
Hoja de trabajo
1.¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica? Utilizamos sangre capilar

2.¿Para que se utiliza el visualizador? Para observar la aglutinación (si hay) ya que el calor favorece la aglutinación.

3.¿Qué puede dar lugar a falsas aglutinaciones? Pequeños coágulos de fibrina contenidos en la muestra.

4.¿Qué ocurre si aglutina la sección A? No se puede informar de los resultados, ya que esta sección debe ser negativa.

DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO AB0

Fecha: 29 de abril, 2015

Fundamento: Determinar el grupo sanguíneo AB0 enfrentando el suero problema a hematíes de cada grupo (A1, A2, B y 0)

Material: Tubos de centrífuga, pipetas pasteur, centrífuga, rotulador de vidrio, gradilla, vasos de precipitado
Reactivos:  Hematíes del grupo A1, del grupo A2, del grupo B, del grupo 0 y de la sangre problema.
Muestra:  Plasma, obtenido centrifugando la sangre problema.
Desarrollo:  
-Realizamos un lavado de hematíes de la sangre problema de la siguiente manera:

• A los hematíes obtenidos, después de centrifugarlos y extraer el plasma, le añadimos unos 3ml de suero salino.
• Lo centrifugamos durante 4 minutos a 2.000 rpm.
• Extraemos el sobrenadante y repetimos la operación dos veces más.

-Preparamos una suspensión de hematíes al 5%: añadimos 250 microlitros de hematíes y 4'75 ml de suero salino y homogenizamos.
-En cada tubo de ensayo le escribimos una letra diferente (A1, A2, B, 0 y C de control)
-Añadimos 2 gotas de plasma a cada uno de los tubos.
-Añadimos una gota de la suspensión de hematíes que se corresponda con la letra del tubo rotulado. Y en el C, en forma de control, los hematíes propios del plasma.
-Centrifugamos los tubos a 1.000 rpm durante 1 minuto y observamos.
Observaciones: Para ver si ha habido aglutinación en los tubos, golpearemos el extremo inferior del tubo para despegar el sedimento hemático y si aparecen unos grumos rojos flotando en un líquido claro es que hay aglutinación

Resultados: 
Interpretación de los resultados: 
Hoja de trabajo
1.¿Qué son los hematíes tipados? 

2.¿A qué dilución empleamos los hematíes del paciente? Deben estar a una dilución del 5%

3.¿Qué clase de muestra se emplea en esta muestra?Suero obtenido mediante coagulación de la sangre. 

4.¿Qué ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación? Cuando el tubo C presenta aglutinación se debería repetir las pruebas con otro lavado de hematíes ya que el tubo C debe ser un control negativo.

DETERMINACIÓN CELULAR EN TUBO

Fecha: 23 de abril, 2015

Fundamento: Observar la presencia o no de aglutinación en los hematíes problemas, al enfrentarlos a sueros conocidos que poseen anticuerpos frente a esos antígenos.

Material:  Tubos de centrífuga, rotulador de vidrio, gradilla, pipetas pasteur, pipeta, prepipeta, micropipeta, centrífuga.
Reactivos:  suero anti-A, suero anti-B, suero anti-AB y solución salina fisiológica.
Muestra:  sangre total anticoagulada
Desarrollo:  
-Primeramente realizaremos el lavado de hematíes de la siguiente manera:

• Añadimos 1 ml de sangre problema y 3 ml de solución salina en un tubo de centrífuga, en otro tubo realizamos lo mismo con otra sangre problema o  con agua destilada (para compensar la centrífuga)
• Centrifugamos la sangre a 2.000 rpm durante 4 minutos.
• Decantamos el sobrenandante.

-Una vez tengamos los hematíes, realizaremos una suspensión de hematíes al 2%: Cogeremos 100 microlitros de hematíes (la parte de abajo de el lavado de hematíes) y le añadimos 4,9 ml de solución salina (o 2 gotas de hematíes y 5 ml de solución salina).
-Rotulamos tres tubos de ensayo con las letras A, B y AB.
-Añadimos a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes al 2% y dos gotas de suero anti-A, en el tubo A, de suero anti-B, en el tubo B, y de suero anti-AB, en el tubo AB.
-Centrifugamos los tubos durante a 1.000 rpm durante 1 minuto y observamos los tubos.
Observaciones:  Para observar si hay aglutinación o no, golpearemos suavemente el fondo de cada tubo para desprender el sedimento.

Resultados: 

Interpretación de los resultados: En observar los tubos, no existe aglutinación ninguna, por lo que nuestra sangre problema es del Grupo 0.
Hoja de trabajo
1.¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis? Es la misma técnica que la determinación en porta, es decir, la aglutinación de los hematíes. 

2.¿A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problema? La suspensión se prepara a una concentración del 2% 

3.¿Cómo se ve una aglutinación positiva? Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

4.¿A qué se debe el fenómeno Rouleaux? Se debe al no realizar el lavado previo de los hematíes problema

5.¿Cómo se pueden evitar los falsos positivos? Se pueden evitar realizando un lavado previo de los hematíes.

DETERMINACIÓN CELULAR EN PORTA

Fecha: 22 de abril, 2015

Fundamento: Observar la aglutinación de los hematíes enfrentados a una serie de antisueros conocidos (anti-A y anti-B) para determinar el grupo AB0 del individuo.

Material:  Lancetas, rotulador de vidrio, gasas, portaobjetos, palillos mezcladores y capilar

Reactivos: Alcohol, suero anti-A, suero anti-A1, suero anti-A2 y suero anti-B
Muestra:  Sangre capilar
Desarrollo:  
-Dividimos un portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio y marcamos con la letra A una parte y la otra con la letra B.
-Con una lanceta, nos extraemos sangre y la colocamos en un capilar heparinizado.
-Colocamos una gota de suero anti-A en la sección A y otra gota en el suero anti-B en la sección B.
-Con el capilar, añadimos una gota de sangre al lado de cada gota de suero.
-Mezclamos la gota de sangre con la de suero, con el palillo mezclador
-Observamos la presencia o ausencia de aglutinación.
-En caso de salirnos A, volver hacer el procedimiento con los sueros anti-A1 y anti-A2 para determinar el tipo de A.
-Realizamos una gráfica con los diferentes grupos sanguíneos de las personas de la clase.
Observaciones: Hay aglutinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro. En el caso contrario, los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo.

Resultados: 

Nuestra muestra

Los resultados de los grupos sanguíneos de la clase son los siguientes:

El gráfico sería así: Gráfica grupo AB0

Interpretación de los resultados: 
La presencia o ausencia aglutinación puede parecer de la siguiente manera:

En nuestro caso la muestra se ha aglutinado con el suero anti-B por lo tanto, el grupo sanguíneo de la muestra es el Grupo B.
Hoja de trabajo
1.¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis? La aglutinación de los hematíes enfrentados a una serie de antisueros.

2.¿Qué muestra utilizamos? Sangre capilar o sangre total anticoagulada, citratada u oxalada.

3.¿Cómo se ve la aglutinación positiva? Se observan unos grumos rojos que flotan sobre el líquido

4.¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es A? Reexaminar la reacción del anti-A al cabo de 2 minutos para comprobar que no se ha pasado por alto ninguna reacción débil. Además luego debemos realizar la misma prueba con anti-A1 y anti-A2.

CÁLCULOS DE LOS ÍNDICES ERITROCITARIOS

Fecha: 26 de enero, 2015

Fundamento: Calcular los índices eritrocitarios primarios: Hematocrito (HCT), Concentración de hematíes (RBC) y concentración de hemoglobina ([Hb])  y, a partir de ellos, calcular los índices eritrocitarios secundarios: volumen corpuscular medio (VMC), hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH o CHCM).

Desarrollo: 
-HCT -> véase práctica XIV
-RBC -> véase práctica XIII
-[Hb] -> véase práctica XVII

Resultados: 
-Hematocrito (HCT)

-Concentración hematíes (RBC)

-Concentración hemoglobina ([Hb])

-Volumen corpuscular medio (VCM)

-Hemoglobina corpuscular media (HCM)

-Concentración corpuscular media de Hb (CHCM)

Interpretación de los resultados:
Hoja de trabajo
1.Con los datos siguientes, calcule el VCM, HCM y CHCM.
HCT= 41'8%; Hb= 14'5g/dl; RBC= 4'86 millones/ mm3

VCM= 8'6 x 10^ -5;  HCM= 2,98x 10 ^-5;  CHCM= 34'68 g/dl

2.Con los datos de volumen corpuscular de tres hematíes, calcule su IDH.
X1= 93fl; X2= 92 fl; X3=90 fl

3.Con los datos de hemoglobina corpuscular de ocho hematíes, calcule su ADH.
X1= 20g/dl; X2= 21g/dl; X3= 21g/dl; X4= 20g/dl; X5= 12g/dl; X6= 12g/dl; X7= 11g/dl; 13g/dl.

DETERMINACIÓN FUNCIONAL DE FIBRINÓGENO

Fecha: 09 de marzo, 2015

Fundamento: Realizar una determinación cronométrica de fibrinógeno, según el método de von Clauss (se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y, por tanto, en forma de coágulo).

Material: gradilla, tubos de ensayo de plástico, micropipeta, puntas de micropipetas, rotulador de vidrio, cubetas de coagulómetro, trocitos de acero para las cubetas, coagulómetro, bolígrafo, hoja milimetrada.

Reactivos: R1 (trombina bovina), R2 (tampón imidazol), R3 (solución caolín) y coagulation cal
Muestra: PPP (plasma pobre en plaquetas) 
Desarrollo: 
-Preparamos una dilución 1/10 de la muestra y los controles en Tampón Imidazol (0'05 ml de muestra + 0'45 ml de tampón imidazol).
-Preparamos las diluciones del calibrador en tampón imidazol:

-Colocamos 5 trocitos de acero en las cubetas del coagulómetro, perfectamente rotuladas, y le añadimos 0'2 ml de cada dilución y de la muestra, cada uno respectivamente en su cubeta rotulada.

-Añadimpos 0'02 de R3 en cada cubetas y lo atemperamos, en la placa calefactora entre 4 y 6 minutos.

-Vamos introduciendo, consecutivamente, cada una de las cubetas en la celda de medida del coagulómetro y le añadimos 0'1 ml de R1 (sin atemperar).

-Antomos0 los tiempos y realizamos una curva de actividad con las diluciones del calibrador y luego colocamos la muestra.

Resultados: 

Interpretación de los resultados: Los valores normales de la fibrinogenemia oscila entre los 150 mg/dl y los 450 mg/dl. Nuestra muestra está por debajo de esos valores normales (más o menos 58) , que puede deberse a trastornos congénitos ( afibrinogemia congénita) o adquiridos (hepatopatías).
Hoja de trabajo
1.¿De qué tipo es la determinación de fibrinógeno realizada en esta práctica? Es una determinación funcional de fibrinógeno.

2.¿A qué concentración esta la trombina bovina? Está a una concentración de 100 U NIH/ml.

3.¿A qué dilución se somete a la muestra? La muestra se somete a una dilución de 1/10.

4.¿Cuál es la fibrinogenemia normal? La fribinogenemia normal oscila entre los 150 y los 450 g/dl.

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)

Fecha: 05 de marzo, 2015

Fundamento: Determinar el tiempo que tarda en coagular un PPP (plasma pobre en plaquetas), cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hística.

Material: gradilla, cubetas coagulómetro, trocito de acero para la cubeta, coagulómetro, rotulador de vidrio, micropipeta, puntas de micropipeta, baño de aguia, tubos de ensayo de plástico.

Reactivos:  tromboplastina cálcica
Muestra:  PPP (plasma pobre en plaquetas)
Desarrollo: 
-Colocamos el volumen de tromboplastina que se va a necesitar, en un tubo de ensayo de plástico correctamente rotulado, y otro tubo de ensayo con la muestra.
-Atemperamos en el baño, a 37ºC, la muestra y la tromboplastina, entre 5 y 15 minutos.
-Colocamos un trocito de acero en una cubeta de coagulometro, y vertemos 0'1 ml de muestra en esa cubeta, y en otra cubeta (sin trocito de acero) vertemos 0'2 ml de tromboplastina.
-Incubamos las dos cubetas en la placa calefactora del coagulometro durante unos 2 minutos.
-Colocamos la cubeta de la muestra en la celda de medida del coagulómetro y le añadimos 0'2ml de tromboplastina.
-Anotamos el tiempo y lo colocamos en la curva de actividad préviamente hecha (véase práctica XL) 

Resultados: 
TP de la muestra en segundos -> 29'8s
% actividad protrombina contenida en la muestra, mediante la curva -> 54%
TP del plasma control normal no diluido -> 5'4s
Ratio entre el TP de la muestra y el TP del control -> 8'31
ISI -> 1'24

Interpretación de los resultados:  Los valores normales del TP están comprometidos, entre los 11 y 15 segundos y el % de actividad entre el 70 y el 100%. Por lo tanto la muestra de nuestro paciente esta un poco por debajo de los valores normales.
Hoja de trabajo
1.¿Qué índice expresa la sensibilidad de una tromboplastina hística? El Índice de Sensibilidad Internacional (ISI).

2.¿Cómo se llama la ratio de protrombina corregida? Se denomina INR

3.¿Cuál es el % normal de actividad de la protrombina? Oscila entre el 70 y el 100%.

4.¿En qué circunstancias se altera el TP? En pacientes con déficits de factores de la vía extrínseca, en enfermos sometidos a terapias con dicumarinas y en pacientes que sufren algunos trastornos hepáticos.

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA

Fecha: 05 de marzo, 2015

Fundamento: Realizar una curva de actividad de la protrombina para expresar el tiempo de protrombina (TP) en forma de porcentaje de activdad.

Material: Tubos de ensayo de plástico, rotulador de vidrio, micropipeta, puntas de micropipeta, cubetas de coagulómetro, trocitos de acero para las cubetas, coagulómetro, baño de agua, bolígrafo, regla, hoja de papel milimetrado, gradilla

Reactivos:  Solución salina (0'085%), tromboplastina cálcica, pool de plasma normales o plasma control normal.
Desarrollo: 
-Preparamos una batería de disoluciones de la siguiente manera:

-Depositamos el volumen que necesitamos de tromboplastina cálcica en un tubo de ensayo, y lo atemperamos en el baño a 37ºC entre 5 y 15 minutos.

-Colocamos un trocito de acero en 5 de las cubetas del coagulómetro y le rotulamos a cada una el % de actividad de cada disolución (100, 50, 33, 25 y 10).

-Vertemos 0'1 ml de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas rotuladas con el % de actividad correspondiente.

-Incubamos las 5 cubetas en la placa calefactora del coagulómetro entre 3 y 5 minutos.

-Colocamos, sucesivamente, cada una de las cubetas, en la celda de medida del coagulómetro, le agregamos 0'2 ml de tromboplastina cálcica y anotamos el tiempo de cada una.

Resultados: 

Hoja de trabajo
1.¿Con qué se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal? Se diluye con agua destilada.

2.¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2? Tiene un porcentaje de activdad del 50%

3.¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro? Cuando se agrega el RT

4.¿Qué se anota en el eje de ordenadas? Se anotan los valores en segundos del TP del plasma control no diluido y de cada uno de sus diluciones.

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPA)

Fecha: 04 de marzo, 2015

Fundamento: Determinar el tiempo que tarda en coagular un plasma pobre en plaquetas (PPP), tras su recalicificación (adición  de una soluciónde cloruro cálcico) y en presencia de un sustituto de f3p (cefalina).

Material:  gradilla, cubetas de espectrofotómetro, trocitos de acero para las cubetas, rotulador de vidrio, micropipeta, puntas de micropipeta, coagulómetro, baño de agua y tubos de ensayo de plástico.

Reactivos: Solución de cloruro cálcico (0'025M), cefalina activada con ácido elágico y un pool de plasma normales o un plasma control normal. 
Muestra: Plasma pobre en plaquetas (PPP).
Desarrollo: 
-Depositamos el volumen total que vamos a necesitar de cada reactivo y el de la muestra, y los rotulamos.
-Atemperamos los reactivos y la muestra, en el baño, a 37ºC de 5 a 15 minutos.
-Introducimos un trocito de acero en dos cubetas de espectrofotómetro.
-Rotulamos el extremo superior de la cubeta, una con la letra M (muestra) y otra con la letra C (control).
-Añadimos 0'1ml de muestra en la cubeta M y 0'1ml de plasma control en la cubeta C.
-Añadimos 0'1ml de cefalina activada a cada una de las cubetas, homogenizamos bien y colocamos las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro (durante 2 minutos).
-Colocamos, sucesivamente, cada cubeta  en la celda de medida del coagulómetro y añadimos 0'1 ml de cloruro cálcico.

Resultados: 

TTPA de la muestra -->62'6 segundos
Ratio --> 2'23
TTPA del control --> 28'07 segundos
Interpretación de los resultados:  Los valores normales de TTPA están comprendidos habitualmente, entre los 30 y 40 segundos y también se puede considerar un TTPA normal si el de la muestra no es superior en más de 8 segundos al del control.
En nuestro caso el TTPA de la muestra está alargado lo que indica un déficit en los factores de la vía intrínseca de la coagulación
Hoja de trabajo
1.¿De dónde se obtiene el sustituto de f3p? Se obtiene a partir de cerebros de conejo.

2.¿Cómo se llama el sustituto del f3p? Se llama cefalina

3.¿Qué activadores de los factores del contacto se pueden utilizar? Se pueden utilizar varias sustancias, principalmente: el caolín, el polvo  de vidrio, el sílice, el celite y el ácido elágico.

4.¿Cuántos segundos debe superar el TTPA de la muestra al del control para ser considerado anormal? Debe ser superior a más de 8 segundos.