DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA

Fecha: 19 de enero, 2015

Fundamento: Determinar la cantidad de hemoglobina en sangre, utilizando la técnica de la cianmetahemoglobina, mediante cálculos y mediante curva de calibración.

Material: Tubos de ensayo, gradilla, espectrofotómetro, micropipeta, vaso de precipitado, pipeta (5ml), prepipeta, rotulador de vidrio y cubetas de espectrofotómetro.

Reactivos: Hemoglobin 50X (Ferricianuro de potasio (0'60mmol/l), cianuro de potasio (77mmol/l) y dihidrogeno fosfato de potasio (2mmol/l)) y patrón de hemoglobina (a diferentes concentraciones). 
Muestra:  Sangre venosa anticoagulada con EDTA.
Desarrollo: 
-Preparamos las diferentes concentraciones  del patrón de hemoglobina:

• Patrón 1: cogemos 1 ml del patrón de la casa comercial (concentración: 15g/dl).
• Patrón 2: cogemos 0'5 ml del patrón comercial y le añadimos 0'5 ml de agua destilada (concentración: 7'5g/dl).
• Patrón 3: cogemos 0'5 ml del patrón 2 y le añadimos 0'5 ml de agua destilada (concentración; 3'75g/dl).

-En cada tubo de ensayo, con un rotulador de vidrio, escribimos en cada uno lo que contendrá (blanco, patrón 1, patrón 2, patrón 3).

-Preparamos los tubos de ensayo de la siguiente manera:

-Una vez mezclado, incubamos los tubos 3 minutos a temperatura ambiente.

-En cada una de las cubetas escribimos lo mismo que en en los tubos de ensayo y le añadimos lo de los tubos de ensayo.

-Preparamos el espectrofotómetro para la absorbancia con las siguiente condiciones:

• Longitud de onda: 540 nm.
• Volumen: 100
• Tempertura: 0
• Tiempo: 0

-Vamos colocando cada una de las cubetas en su orden (blanco, patrón 1, patrón 2, patrón 3, muestra 1 y muestra 2) para que el espectrofotómetro vaya absorbiendo.

-Vamos anotando las absorbancias que salgan.

-Una vez anotadas todas, realizamos una curva de calibración.

• Colocamos en el eje Y la absorbancia, y en el eje X la concetración.
• Anotamos, en la gráfica, las absorbancias de los tes patrones.
• Realizamos una recta que pase lo más próximo posible de los tres puntos.
• Anotamos las aborsbancias de las dos muestras.

Observaciones:  Los resultados de la concentración de las muestras es más exacto con la fórmula de la recta, así pues para la interpretación de los resultados cogeremos esos.
Resultados: 

Patrón 1: [Hb]=15g/dl; A=0'136

Patrón 2: [Hb]= 7'5g/dl; A=0'069

Patrón 3: [Hb]=3'75g/dl; A=0'056

Muestra 1: [Hb]=0'260/0'136x15=28'67g/dl; A=0'260

Muestra 2: [Hb]= 0'206/0'136x15=22'720g/dl; A=0'206

Interpretación de los resultados:  Los valores normales de concentración de la hemoglobina son:
Varones --> 14-18 g/dl
Mujeres --> 11-16 g/dl
Niños -->10-14 g/dl
Nuestros resultados son más elevados que los valores normales, eso puede deberse a una sangre ya estropeada (demasiado tiempo en la nevera)
Hoja de trabajo
1.¿En qué se basan los métodos de determinación de la hemoglobina? Se basan en las propiedades fisicoquímicas de la molécula de hemoglobina.

2.¿Cuál es el método más recomendado por el Comité internacional para la estandarización de la Hematología? El método mas recomendado es el método colorimétrico de la cianometahemoglobina.
3.¿De dónde procede el 20 de la fórmula para calcular la concentración? 

DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE LOBULARIDAD (IL)

Fecha: 08 de enero, 2015.

Fundamento: Calcular el índice de lobularidad de los neutrófilos, clasificándolos según Arneth.

Material: microscopio, bolígrafo, papel, 2 portaobjetos, duquesitas, pipeta Pasteur

Reactivos: Solución nº1: solución alcohólica de triarilmetano, solución nº2: solución tamponada de xanteno, solución nº3: solución tamponada de tiazina, agua destilada, aceite de inmersión.

Muestra: Sangre venosa

Desarrollo:
-Realizamos una extensión y la teñimos con Panóptico rápido (véase práctica XI)
-Colocamos la extensión en el microscopio y la observamos con el objetivo de inmersión.
-Buscamos neutrófilos y contamos sus lobulaciones (se considera que hay un lóbulo cuando una parte del núcleo está unida al resto solamente por un fino puente de cromatina).
-Terminamos el recuento cuando hayamos contado 100 neutrófilos.


Observaciones: Si los valores fueran inferiores a 1'9 habría una desviación a la izquierda (con neutrofilia o neutropenia) y si fueran mayores de 3 habría una desviación a la derecha (varios procesos patológicos).
Resultados: 

Interpretación de los resultados: Los valores normales del índice de lobularidad (IL) está comprendido entre 1'9 y 3. Por lo tanto, nuestro resultado está dentro de los valores normales, por lo que el paciente está sano.
Hoja de trabajo
1.¿Cuántos tipos de neutrófilos hay según Arneth? Hay cinco tipos de neutrófilos (dependiendo del número de lóbulos que tengan).
2.¿Qué tipo de desviación hay si el IL es igual a 2,5? No hay ninguna desviación ya que el IL normal esta entre 1,9 y 3.
3.¿De qué enfermedades es típica la desviación a la izquierda con neutrofilia? Es típica de infecciones agudas (apendicitis, sepsis, etc.)

PRUEBA DE MEZCLA CON PLASMA NORMAL

Fecha: 10 de marzo, 2015

Fundamento: Mezclar plasma normal con el plasma problema, para ver si se corrige los tiempos determinados del plasma problema.

Material: gradilla, cubetas de coagulómetro, trocitos de acero para las cubetas, rotulador de vidrio, micropipeta, puntas de micropipeta, coagulómetro, baño de agua, tubos de ensaño de plástico.
Reactivos: coluro cálcico (0'025M), cefalina activida con ácido elágico, pool de plasma normal. 
Muestra: Plasma anormal 
Desarrollo: 
-En un tubo de ensayo, preparamos, a partir del plasma anormal, una dilución 1/2 con plasma normales o con el plasma control normal.
-Homogenizámos la muestra obtenida y lo incubamos en el baño de agua durante 60 minutos.
-Una vez pasado ese tiempo, realizamos, con esa muestra, la prueba de TTPA (veáse práctica XXXIX)

Observaciones: La prueba de mezcla con plasma normal, se practica cuando el plasma problema se determina un TP normal y un TTPA alargado. 
Resultados: 
Tiempo de la tromboplastina parcial activada de la muestra -> 20'7 segundos.
Interpretación de los resultados: Los valores normales del TTPA están comprendidos, habitualmente, entre los 30 y los 40 segundos, un tiempo superior se considera alargado. 
En realizar la mezcla de plasma vemos que el TTPA se a corregido por lo que al paciente del plasma anormal le falta algún factor de la vía intrínseca (F. VIII, IX, XI o XII).
Hoja de trabajo
1.¿Cuándo debe hacerse una prueba de mezcla con plasma normal? Se realiza cuando alguno de los tiempos determinados en el plasma problema (principalmente en el TTPA) está alargado.

2.Si tras la mezcla con plasma normal, no se corrige el TTPA, ¿qué se debe investigar? Se  debe investigar la presencia, en el plasma, de un inhibidor de la coagulación (heparina, PDF, inhibidor tipo lupus, etc.)

PRUEBA DE LA SACAROSA

Fecha: 27 de febrero, 2015

Fundamento: Realizar la prueba de la sacarosa para determinar si existe o no HPN (hemoglobinuria paroxística nocturna).

Material: Pipetas pasteur, pipetas graduadas, micropipeta, punta de micropipeta, tubos de centrífuga, reloj, centrífuga, espectrofotómetro, rotulador de vidrio, gradilla, cubetas de espectrofotómetro.
Reactivos:  Solución acuosa de sacarosa (9'24%), sangre control, solución acuosa de amoniaco (0'04%) y suero fisiológico.
Muestra:  sangre venosa, completa y anticoagulada con oxalato cálcico, EDTA o ACD
Desarrollo: 
-Rotulamos 3 tubos. Uno con las siglas SF (suero fisiológico), otro con las siglas SC (sangre control) y otro con las siglas SP (sangre problema).
-Rellenamos los tubos de la siguiente manera:

-Agitamos suavemente los tubos y los dejamos en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos.

-Centrifugamos los tubos a 2.000 rpm durante 5 minutos.

-Para realizar la lectura espectrofotométrica se realiza de la siguiente manera:

• Preparamos otros tres tubos y los rotulamos, uno con TB (tubo blanco), otro con TPr (tubo patrón) y el otro con TPa (tubo problema).
• Rellenamos los tubos de este modo:

                                   

• Homogenizamos los tubos y añadimos en cada cubeta de espectrofotómetro cada tubo.
• Los colocamos en el espectrofotómetro y se anota la absorbancia de cada uno.

Observaciones:  La sangre utilizada es extraída de la bolsa de la nevera, que lleva mucho tiempo, por lo que la sangre esta hemolizada y los resultados obtenidos no son buenos.
Resultados: 

Los resultados obtenidos se pueden observar de dos maneras: lectura visual y lectura espectrofotométrica.
Lectura visual:

Lectura espectrofotométrica:

Interpretación de los resultados: En los tubos de la lectura visual en el SF y SC no deberían salir hemólisis ya que éstos funcionan como control negativo.
El grado de positividad que se produce en la HPN oscila entre el 10 y el 80% de hemólisis.
Hoja de trabajo
1.¿Con qué se hemolizan los hematíes vertidos en el tubo problema? Con una solución de sacarosa.

2.¿A qué concentración se prepara la solución de sacarosa? Se prepara a una concentración del 9'24%.

3.¿Cómo se llama también a la sacarosa? También se le denomina azúcar común

4.¿Qué es el ACD? 

5.¿Cómo se prepara el tubo blanco? Se prepara con 5 ml de una solución de amoniaco, y 0'3 ml de suero fisiológico.

6. ¿Qué porcentaje de hemólisis suele producirse, con la prueba de la sacarosa, en la sangre de la HPN?  Oscila entre un 10 y un 80% de hemólisis.

DETERMINACIÓN DEL TEST DE HOWELL

Fecha: 03 de marzo, 2015

Fundamento: Medir el tiempo que tarda en coagularse un plasma rico en problemas (PRP), obtenido a partir de una muestra de sangre anticoagulada con citrato, cuando se vuelve a recalcificar.

Material: Rotulador de vidrio, tubos de hemólisis, tubos de centrífuga, micropipeta, puntas de micropipeta, baño de agua, centrífuga, cronómetro, pipeta pasteur.

Reactivos: solución salina (0'85%), solución de cloruro cálcico 0'025 M (cloruro cálcico, 0'28g + agua destilada, 100ml) y un plasma control normal.
Muestra: Sangre anticoagulada con citrato.
Desarrollo: 
-Preparamos el PRP (nuestra muestra) de la siguiente manera:

• En dos tubos de centrífuga, añadimos la misma cantidad de sangre en cada uno.
• Los metemos en la centrífuga y los centrifugamos a 1.000 rpm durante 10 minutos.
• Una vez centrifugado, extraemos los tubos, recogemos el sobrenadante (plasma) y lo introducimos en un eppendorf.

-Encendemos el baño de agua y esperamos que éste este a 37 ºC.
-Atemperamos los reactivos y la muestra a 37 ºC (en el baño), entre 5 y 15 minutos.
-Rotulamos, en un tubo de centrífuga una M de muestra y en otro una C de control, y los introducimos en el baño de agua.
-Depositamos, 0'1 ml de muestra en el tubo M y 0'1 ml de plasma control en el tubo C.
-Añadimos 0'1 ml de solución salina a cada uno de los tubos.
-Añadimos, a cada uno, 0'1 ml de solución de cloruro cálcico e inmediatamente ponemos en marcha el cronómetro.
-Cogemos los tubos por el extremo superior y, sin sacarlos del baño, comenzamos un movimiento de balanceo.
-Paramos el cronómetro, en el momento que se vea una aparición de un enturbiamento y de una solidificación en cada uno de los tubos.

Observaciones:  Los valores normales están comprendidos entre los 90 y los 130 segundos. El tiempo es mayor al normal en los déficits de factores de la via intrínseca, en situaciones de afribrinogenemia y de hiperfribinolisis, y en terapias con heparina.
Resultados: 

Tiempo que tarda en coagular la muestra -->  2 minutos

Tiempo que tarda en coagular el control --> 1'45 minutos

Interpretación de los resultados:  El tiempo de la muestra obtenido esta entre los valores normales, por lo que el tiempo obtenido es normal.
Hoja de trabajo
1.¿Qué tipo de muestra se utiliza en esta prueba? Se utiliza un plasma rico en plaquetas (PRP).

2.¿A qué concentración está el CaCl2 empleado en este test? Está a una concentración de 0'025 M.

3.¿Cuáles son los valores normales del test de Howell? Los valores normales están comprendidos entre los 90 y los 130 segundos.

4.¿Qué tratamiento puede ser controlado con este test?  

PRUEBA DE RUMPEL-LEEDE

Fecha: 05 de marzo, 2015.

Fundamento:  Evaluar la resistencia que ofrecen las paredes capilares al aumento de la presión intracapilar y la anoxia.

Material: Boli, esfigmomanómetro, fonendoescopio y un reloj.

Desarrollo:  
-Observamos la posible presencia de petequias (pequeñas manchas cutáneas que no desaparecen al comprimirlas con el dedo) en la extremidad superior del objeto del estudio.
-Medimos la presión arterial del paciente, de la siguiente manera:

• Colocamos el manguito esfigmomanómetro apretado (pero sin cortar el riego sanguíneo) y dentro el fonendoescopio, arriba de la doblez del codo del brazo izquierdo.
• Empezamos a insuflar aire al manguito, hasta alcanzar los 160 mm de Hg.
• Soltamos el aire poco a poco hasta empezar a escuchar como una especie de golpecitos. Anotamos en el momento que empieza (la presión máxima) y también anotamos en la zona dónde se dejan de escuchar los golpecitos (la presión mínima).
• Calculamos la media de las dos presiones.

-Dibujamos un círculo, de unos 5 cm de diámetro, en la cara anterior del antrebrazo elegido para la prueba, a unos 5 cm de la flexura del codo.
-Colocamos el manguito del esfigmómetro en el brazo, le insuflamos aire hasta la media de las presiones y mantenemos la presión 5 minutos.
-Aflojamos el manguito. observamos el círculo dibujado y contamos el número de petequias.
Observaciones: El resultado de la prueba es negativo si hay menos de 10 petequias, es dudoso si está comprendido entre 10 y 20 petequias y es claramente positivo si hay más de 20 petequias.
Resultados:

                                                                                                      
Interpretación de los resultados: No se observan petequias por lo que el resultado es negativo.
Hoja de trabajo
1.¿Cuánto tiempo se deja puesto el esfigmomanómetro en esta prueba? Se deja puesto durante unos 5 minutos.
2.¿Cómo se aprecian las petequias? Se aprecian como pequeñas manchas cutáneas de color rojizo,que están constituidas por acúmulos de sangre, y que no desaparecen cuando se ejerce una compresión con un dedo sobre ellas.
3.¿Cuántas petequias debe contener el círculo para que el resultado sea claramente positivo? Si hay más de 20 petequias el resultado es claramente positivo.
4. ¿En qué enfermedades hay una prueba de Rumple-Leede positiva? Se aprecia en las enfermedades de von Willerbrand, en el escorbuto y, sobre todo, en las púrpuras vasculares.

DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)

Fecha: 02 de marzo, 2015.

Fundamento: Determinar la velocidad de sedimentación globular de los hematíes, es decir, medir la rapidez con la que sedimentan los hematíes de una muestra.

Material: Pipeta desechables de vidrio especial (graduada de 0 a 170 y en su interior alberga un émbolo de aspiración de plástico blanco), tubo mezclador de polipropileno con tapones de goma perforable, micropipeta y reloj.
Reactivos:  Citrato sódico al 3'8%(en el interior del tubo mezclador)
Muestra:  Sangre venosa anticoagulada
Desarrollo: 
-Abrimos el tubo mezclador y, con una micropipeta, le añanadimos 1 ml de sangre.
-Homogenizamos la sangre con el citrato sódico suavemente y volvemos a tapar el tubo.
-Con firmeza pero con cuidado, para no romper la pipeta, introducimos la pipeta en el tubo (por el tapón de goma) y esperamos que llegue al cero.
-Colocamos el tubo en una gradilla para que no se mueva y esperamos una hora.
-Después de esa hora, anotamos los milímetros en dónde se encuentran los hematíes separados del plasma.
-Lo dejamos otra hora y volvemos a anotar.
Observaciones:  La sangre utilizada por nosotros para esta practica es sangre que llevaba mucho tiempo en la nevera por lo que los resultados no serán concluyentes. Los valores normales de VSG són: 

Y los valores normales del Índice de Katz oscila entre 2 y 16.

Resultados: 

     

                                                                                                     
Interpretación de los resultados:  Los resultados obtenidos (ya sea en VSG o conel índice de Katz) són inferiores a los valores normales, eso suele suceder en hepatopatías graves que conllevan una hipoproducción de fibrinógeno. Aunque la alteración de VSG es inespecífico ya que señala la presencia de una enfermedad activa, pero no ofrece casi datos acerca del tipo de proceso patológico que la origina ni de la gravedad de éste.
Hoja de trabajo
1.¿Cómo se llama la carga electrostática negativa de los glóbulos rojos? Se llama potencial zeta
2.¿Qué anticoagulante es el más apropiado para realizar una determinación de VSG? El más apropiado es el de citrato sódico al 3'8%.
3.¿A qué temperatura se recomienda practicar la determinación de VSG? Se recomienda a temperatura ambiente (20-25 ºC) para evitar las alteraciones de VSG
4. ¿Qué ocurre si la pipeta de VSG está inclinada durante la determinación? Si se inclina hace que aumente la VSG
5. ¿A qué tiempos se efectúa la lectura de la VSG? Pasado una hora y dos horas.
6.¿En qué circunstancias fisiológicas aumenta la VSG? Es más alta en la mujer y aumenta en la vejez y a partir del tercer mes de embarazo.